Може ли инженерните червени кръвни клетки да бъдат ефективен антивирусен препарат срещу ТОРС-CoV-2?

[ad_1]

Червените кръвни клетки са ануклеатни клетки, които са най-разпространеният тип клетки в тялото, присъстващи във всички тъкани, с продължителност на живота 120 дни. Те също нямат молекули от основен комплекс за хистосъвместимост от клас I и по този начин тип О отрицателни еритроцити могат да се използват от всички пациенти. Това автоматично ги прави идеални като транспортни средства за терапевтични молекули при редица състояния, включително продължаващата пандемия на коронавирусната болест 2019 (COVID-19).

Изследване: Характеризиране in vitro на инженерните червени кръвни клетки като мощни вирусни капани срещу HIV-1 и SARS-CoV-2.

В ново проучване, публикувано на bioRxiv* сървър за предпечат, екип от изследователи изследва антивирусния потенциал на червените кръвни клетки срещу тежък остър респираторен синдром коронавирус 2 (SARS-CoV-2), причинителят на COVID-19.

Постигане на високи нива на HIV-1 рецептори

Инженерните еритроцити могат да се използват за проектиране на вирусни капани, които привличат вируси, за да се свържат и да ги заразят. Това се постига, като им се даде възможност да представят вирусни рецептори на повърхността си. Вирусите, които заразяват червените кръвни клетки, не могат да се репликират поради липсата на нуклеинова киселина, който защитава действителните целеви клетки гостоприемник от инфекция.

За да експресира протеин, клетката трябва да има механизъм за транслация, който отсъства в зрелите еритроцити. За да се направи това, еритроидните клетки-предшественици трябва да бъдат проектирани, преди да се диференцират. По време на процеса на зреене, експресията на трансгени обикновено се предотвратява чрез заглушаване на транскрипцията, механизми, които контролират протеиновия синтез от транскрибирани гени и разграждането на протеини, които обикновено не се намират в червените кръвни клетки.

Експресия на трансген

За да постигнат това, изследователите комбинират трансгенна експресионна система заедно с оптимизация на трансгенен кодон, за да позволят на червените кръвни клетки да експресират HIV-1 рецепторите CD4 и CCR5 на високи нива. Това трансформира енуклеираните еритроцити във вирусни капани, които са мощни инхибитори на HIV-1 инфекцията.

За първи път изследователите са приложили in vitro протокол за диференциране на човешки CD34 + хемопоетични стволови клетки (HSC) в ретикулоцити (незрели еритроцити, които все още съдържат рибозомна РНК и следователно все още могат да извършват транслация на протеини, но липсват ядра). Пролиферацията на HSC беше последвана от вмъкването на “чуждите” CD4 или CCR5 гени в еритроидните клетки-предшественици от лентивирусни вектори.

Освен това изследователите вмъкват ген за експресия на CD4-гликофорин А (CD4-GpA) слет протеин. Този протеин е съставен от CD4 D1D2 извънклетъчни домейни, слети към N-терминалния край на общия RBC протеин, GpA. Това трябваше да позволи еднодоменни антитела да се експресират в еритроцитите. CD4 е еднопроходен, а CCR5 многопроходен трансмембранен протеин. Този протокол е подходящ само за CD4, но не и за CCR5

Те откриха, че използването на CMV промотор или повсеместни промотори води до ниска експресия на трансген. Поради това те преминаха към използване на специфичен за еритроидите промотор, използвайки CCL-βAS3-FB лентивирус. Този вектор съдържа елементи, които повишават експресията на бета-глобин по време на развитието на червените кръвни клетки. Тези векторни елементи включват β-CD4, β-CD4-GpA и β-CCR5.

Резултатът беше голямо увеличение на CD4 експресията, по-малко подобрение на CCR5 и без промяна в CD4-GpA. Причината, свързана с това, е малкият брой рибозомни и трансферни РНК в рамките на РНК, което ограничава експресията на трансгени в диференциращите еритроцити.

Кодон оптимизация

За да се справят с това, те оптимизират трансгенните кодони, като гарантират, че генерират cDNA последователности, които подобряват експресията на всички трансгени.

Тези инженерни клетки претърпяха ефективна диференциация в енуклеирани RBC, почти всички експресиращи GpA, докато една на всеки три експресира високи нива на CD4 и CCR5, подобни на тези на CD4 + Т клетки. Около 6% от CD4-CCR5-RBC са заразени с тестовия HIV-1 вирус, в сравнение с 0,3% или по-малко от контролните RBC или CD4 + RBC. Като цяло, следователно, това възлиза на около една пета от всички CD4-CCR5-RBC.

При CD4-CXCR4-RBCs се наблюдава по-висок процент на инфекция. Степента на заразяване е ниска при CD4-GpA-CCR5 или CD4-GpA-CXCR4 клетки. Това продължи дори с добавянето на CD4 D3D4 домейни. Причината за такива ниски честоти на инфекция може да бъде неспособността на CD4-GpA да се локализира съвместно с CCR5 и CXCR4 ко-рецепторите, тъй като GpA не може да се локализира до липидни поддомейни, за разлика от CD4.

Проектираните еритроцити мощно неутрализират HIV-1

Потенциалът за вирусно улавяне е оценен чрез тест за неутрализация на HIV-1. Това показа, че е възможно да се постигнат терапевтични концентрации in vivo, тъй като полумаксималната инхибиторна концентрация (IC50) за HIV-1 псевдовируси е 1,7×106 RBCs / mL, което е около 0,03% от концентрацията на RBC в човешката кръв. По-високото ниво на експресия на CD4-GpA повишава неутрализиращата активност четирикратно.

По-ниска неутрализираща активност настъпва, когато CCR5 се експресира съвместно с CD4 или CD4-GpA RBC, 2-3 пъти, може би защото CCR5 причинява малък спад в нивото на експресия на CD4-GpA и CD4. Необходими са обаче проучвания in vivo, за да се демонстрира потенциалът за полза с ко-експресията на CCR5 върху вирусни капани на RBC.

Тяхната работа върху вирусоподобни наночастици, представящи клъстери от CD4 (CD4-VLPs), показва, че способността на тези частици да взаимодействат с протеиновите тримери с обвивка на HIV-1 им позволява да неутрализират различни щамове на HIV-1, като същевременно блокират вирусното бягство in vivo. Интересното е, че такива взаимодействия увеличават ефикасността на CD4-VLP с над 10 000 пъти в сравнение с разтворимите CD4 и CD4-Ig инхибитори. Настоящото проучване показва, че същото ниво на ефикасност може да се очаква при използването на вирусни капани на RBC и CD4-VLP чрез взаимодействия с висока степен на авидност с HIV-1 Env антигени.

Постоянно генериране на вирусни капани на RBC

След това тази стратегия беше използвана за получаване на еритроидни прогениторни линии, които продължават да генерират мощни RBC вирусни капани срещу HIV-1 и SARS-CoV-2. За да се уверят, че тези вирусни капани ще се произвеждат непрекъснато, изследователите модифицират обезсмъртена еритробластна клетъчна линия (BEL-A), за да експресират CD4-GpA при високи стабилни нива. Те откриха, че са претърпели ефективна диференциация в енуклеирани еритроцити в над половината клетки, като същевременно продължават да експресират създадения антиген. Тези клетки мощно неутрализират HIV-1 инфекцията с IC50 от 2,1×107 Еритроцити / ml.

SARS-CoV-2 използва приемния клетъчен ангиотензин-конвертиращ ензим 2 (ACE2) като свой входен рецептор. Извънклетъчният домен на ACE2 се слива с GpA, за да се създаде химерен протеин, а клетъчната линия BEL-165 A е проектирана да експресира този протеин. Когато това беше изложено на базирана на лентивирус SARS-CoV-2 псевдовирус, изследователите установиха, че вирусът е силно неутрализиран, с IC50 от 7×105 Еритроцити / ml.

Тези резултати предполагат, че клетъчните линии, които се използват за продуциране на такива вирусни капани от еритроцитите, експресиращи определен рецептор на гостоприемник, могат бързо да бъдат генерирани. „Вирусните капани на еритроцитите имат потенциал да станат мощни антивирусни агенти срещу редица вируси.“ Те могат да персистират в организма 120 дни, като по този начин осигуряват непрекъснат контрол на HIV-1 инфекцията.

*Важно съобщение

bioRxiv публикува предварителни научни доклади, които не са рецензирани и следователно не трябва да се считат за убедителни, да насочват клиничната практика / свързаното със здравето поведение или да се третират като установена информация.

[ad_2]