Проучване при животни предполага, че инхибиторът на палмитоилация намалява вирулентността на SARS-CoV-2

[ad_1]

От началото на световното огнище на коронавирусна болест 2019 (COVID-19), повече от 76 милиона са заразени с над 1,68 милиона смъртни случаи. Вирусът, причиняващ тази пандемия, е тежкият остър респираторен синдром коронавирус 2 (SARS-CoV-2), един от седемте патогенни коронавируси да са ударили света досега. Дори когато първите ваксини стартират, търсенето на специфични и безопасни лечения все още продължава, тъй като се появяват нови варианти, налагащи нови блокировки в няколко региона.

Нова предварителна отпечатка за проучване върху bioRxiv* сървър демонстрира способността на инхибитора на синтазната мастна киселина да подобри оцеляването на мишки, заразени с миши вирус на хепатит. По този начин той добавя към сумата от знания за връзката на ТОРС-CoV-2 с метаболизма на холестерола в клетката гостоприемник.

Цели на проучването

Коронавирусите са насочени към множество тъкани в човешкия гостоприемник, включително белите дробове и клетките на горните дихателни пътища, чревните тъкани, бъбреците и черния дроб. Те се свързват с клетките гостоприемници чрез рецептори за ангиотензин-конвертиращ ензим 2 (ACE2) и може би други рецептори като невропилин-1 (NRP1). След като вирусът се прикрепи към ACE2 рецептора, настъпва протеолитично разцепване, като се използват протеази на гостоприемни клетки. Това генерира S2 фрагмент, който се занимава със стимулиране на сливането на клетъчната мембрана на вирус-гостоприемник, което позволява на вируса да влезе в цитозола.

Повечето потенциални терапии са насочени към тази обвързваща стъпка. Понастоящем някои обещаващи оловни съединения включват протеазни инхибитори и разтворими молекули ACE2, които действат като примамки, предотвратявайки ангажирането на вируса с рецепторите на гостоприемника. Високата скорост на мутация на положително сетивните РНК вируси им дава предимство, като им позволява да избегнат специфичното инхибиране, причинено от тези молекули.

Настоящото проучване имаше за цел да разбере как да се разработи широкоспектърен антивирусен препарат, който е насочен към основни аспекти на взаимодействието гост-вирус. Това може да помогне и за борба с бъдещите коронавируси. Настоящото проучване разглежда възможността за използване на инхибитор на палмитоилация за лечение на SARS-CoV-2 инфекция.

Палмитоилация на шипа, необходима за нови вириони

По-ранни доклади показват, че протеин, наречен палмитоилтрансфераза ZDHHC5, заедно със своя свързващ партньор Golga7, взаимодействат с протеина на SARS-CoV-2. Тяхното изследване, което използва афинитетно пречистване и масспектрометрия, предполага, че опашката на шип протеина, който е в цитозолния домейн, претърпява палмитоилация след генерирането си в клетката гостоприемник. Това е подобно на процеса, който се случва с вируса на миши хепатит (MHV), чийто протеинов пик трябва да има С-терминална палмитоилация, за да може вирусната репликация да продължи успешно.

Ако се предотврати палмитоилация, протеиновият протеин не може да се събере в нови вириони. Мутантният протеинов пик също не е в състояние да стимулира сливането на мембраната, за да образува синцитий чрез сливане на клетъчни клетки, за разлика от дивия тип вирус.

Множество места за палмитоилация

При много коронавируси, които заразяват както човешки, така и миши клетки, С-крайните домени показват обогатяване на цистеинови остатъци в последните 20 остатъка, близо до мембраната. При SARS-CoV-2 10 от първите 20 остатъка са цистеин, позволяващ много пространство за палмитоилация.

Изследователите са използвали клетки HEK293T, позволявайки им да експресират протеина на SARS-CoV-2, маркиран с C9 епитоп на С-терминалния край. Те открили, че тези клетки съдържат редица протеинови видове, някои с пълна дължина, някои от които съдържат субединицата S2 и някои мултимери на протеина.

След това тези клетки се култивират в присъствието на аналогово донорно съединение на палмитат, наречено 15-хексадецинова киселина (15-HDYA). Изследователите искаха да разберат дали този аналог на палмитат може да бъде свързан с протеина на колан ковалентно, независимо дали е с пълна дължина, S2 или мултимерен вид.

След това те използваха ацил-полиетилен гликол (PEG) обмен (APE), метод, който включва превключване на всяка спайкова палмитоилова група за 5-kDa PEG масов маркер. Това би помогнало да се измери колко палмитоилация ще се случи на база на протеин. Те установиха, че протеинът с шипове може да бъде модифициран на множество сайтове. Разглеждайки отделните протеини, имаше поне четири палмитоилови групи.

За сливане на клетъчни клетки е необходимо палмитоилиране на Спайк. (A) Western blot на SARS-CoV-2 Spike-C9 от десетте мутанта на Cys to Ser. (Б) Имунофлуоресценция на SARS-CoV-2 Spike и мутант SpikeC-> S-C9. Мащабни ленти, 10µm (C) Ко-култура на HEK клетки, експресиращи Spike-C9 и ACE2 образуват синциций. Клетките HEK293T, котрансфектирани с mCherry-C1 (пурпурен) и SARS-CoV-2 Spike-C9 (вляво и в средата) или SARS-CoV-2 SpikeC-> S-C9 (вдясно), са култивирани с клетки, трансфектирани с EGFP- C1 (вляво, циан) или и myc-ACE2 (в средата, вдясно). Везни, 20 µm. Стрелките показват слети клетки.

За сливане на клетъчни клетки е необходимо палмитоилиране на Спайк. (A) Western blot на SARS-CoV-2 Spike-C9 от десетте мутанта на Cys to Ser. (Б) Имунофлуоресценция на SARS-CoV-2 Spike и мутант SpikeC-> S-C9. Скала, 10 μm (C) Ко-култура на HEK клетки, експресиращи Spike-C9 и ACE2 образуват синцитий. Клетките HEK293T, котрансфектирани с mCherry-C1 (пурпурен) и SARS-CoV-2 Spike-C9 (вляво и в средата) или SARS-CoV-2 SpikeC-> S-C9 (вдясно), са култивирани с клетки, трансфектирани с EGFP- C1 (вляво, циан) или и myc-ACE2 (в средата, вдясно). Везни, 20 µm. Стрелките показват слети клетки.

Палмитоилация, необходима за образуването на синцитий

След това те използваха техника за индуциране на насочена към мястото мутагенеза, за да преобразуват всичките десет цистеинови остатъка в серин вместо това. Те използваха флуоресцентна микроскопия, за да определят дали клетките-шип-С9 и цистеин> серин шип протеини са еднакво способни да катализират клетъчно-клетъчно сливане с клетки, които експресират АСЕ2. Както се очакваше, те откриха, че многобройни големи синцитии са образувани с spike-C9, но не и с цистеин> сериновия вариант на шипа. “Резултатите показват, че остатъците Cys са необходими за протеина Spike, за да улеснят образуването на синцитий.”

Заглушаването на ZDHHC5 намалява образуването на вирусни плаки

В човешкия геном има 23 ZDHHC (палмитоилтрансферази, съдържащи домен Asp-His-His-Cys на цинков пръст, от които само ZDHHC5 палмитоилира шип протеина на SARS-CoV-2. ефективни за ограничаване на разпространението на вируси в културата, те използват по-малко смъртоносен вирус, човешки CoV 229E, който е подходящ за работа с ниво на биобезопасност 2. Той има цитозолна опашка, която прилича на тази на SARS-CoV-2 и може да бъде палмитоилирана на множество места Подобно на SARS-CoV-2, скокът 229E е способен на ZDHHC5 палмитоилация.

Използвайки клетъчен анализ за 229E със заглушен ZDHHC5, те откриха, че се образуват по-малко плаки спрямо контролите. За да се определи дали това се дължи на нарушена инфекция или последващо разпространение на инфекцията през еднослойния слой клетки, те инкубират клетките с вируса в течна култура. Това показа, че ZDHHC5 е необходим не за първоначална инфекция, а за събиране и освобождаване на инфекциозни вирусни частици.

Инхибирането на FASN предотвратява палмитоилирането на SARS-CoV2

Понастоящем няма специфичен инхибитор на ZDHHC5, но инхибиторът на синтазата на мастна киселина (FASN) церуленин блокира добавянето на палмитоил към NOD1 и NOD2, които са субстрати на ZDHHC5. Тъй като това е токсично съединение, те тестваха друга молекула на инхибитор на FASN, наречена TVB-3166, и бромопалмитат, неспецифичен инхибитор на ZDHHC ензимите. Те открили, че палмитоилацията с шипове е намалена и за двата вируса, докато при анализите, образуващи плаки, броят на плаките, образувани от 229Е, е с 86% по-малък.

Инхибиторът на FASN увеличава преживяемостта на заразени с MHV мишки

Съединението TVB-3166 може да се дава през устата и изследователите го тестваха при мишки, заразени с вируса 229E. Те откриха, че докато контролните мишки показват признаци на заболяване в рамките на два дни след инфекцията, което продължава да прогресира, лекуваните мишки оцеляват за по-дълги периоди и много оцеляват. “Резултатите показват, че намаляването на нивата на палмитоил-CoA е от полза по време на инфекция с CoV, тъй като това намаляване насърчава оцеляването при мишките.”

Последици и бъдещи указания

Следователно проучването предполага, че S2 субединицата палмитоилация е от съществено значение за сливането на вирусна мембрана при вируси на SARS-CoV-2, MHV и SARS. В MHV наистина е необходимо палмитоилирането на шипа, за да му позволи да взаимодейства с мембранния протеин, който му позволява да събере шипа в новите вирусни частици. Добавянето на TVB-3166, независимо дали в клетъчни анализи или в заразени мишки, намалява производството на нови инфекциозни вирусни частици и увеличава оцеляването на мишките.

Механизмът на действие на тази молекула сочи към ролята на променен липиден метаболизъм при коронавирусни инфекции. Някои признаци за това са промени в аполипопротеините и серумните липиди, както и повишените нива на свободни мастни киселини. Тези промени в липидите могат да насърчат вирусната репликация. В ектодомейна на SARS-CoV-2 има и джоб, свързващ линолова киселина, както и други патогенни коронавируси, което показва необходимостта от изследвания за това как мастните киселини и липидният метаболизъм са свързани с коронавирусната инфекция.

По-нататъшни проучвания за тестване на възможната терапевтична роля на TVB-2640, свързан инхибитор на FASN, който вече е в клинични изпитвания за рак и безалкохолно чернодробно заболяване, е наличен през устата и се понася добре при пациенти. Тъй като FASN е ензим гостоприемник, е малко вероятно да се появят вирусни мутации. „Идентифицирането и одобрението на перорално лечение или профилактика с пан-CoV би било от полза в краткосрочен план и в бъдеще срещу други зоонозни CoV.“

*Важно съобщение

bioRxiv публикува предварителни научни доклади, които не са рецензирани и следователно не трябва да се считат за убедителни, да насочват клиничната практика / свързаното със здравето поведение или да се третират като установена информация.

[ad_2]